Von: Prof. Dr. Peter Gmeiner & Dr. Jürgen Einsiedel

Das Neuropeptid Neurotensin (NT) wird als Ausgangspunkt für die Behandlung der Schizophrenie, von starken Schmerzen, aber auch von Tumoren angesehen. Diese möglichen therapeutischen Wirkungen werden vor allem über die beiden molekularen Zielstrukturen Neurotensin Rezeptor 1 und 2 (NTS1 und NTS2) des menschlichen Körpers vermittelt. In den laufenden, von der Dr. Illing Stiftung geförderten Projekten gelang es unserer Forschergruppe, neben dem von unserer Arbeitsgruppe entwickelten Neurotensin Abkömmling JEH12 eine weitere, aktive Leitstruktur mit 600-facher Selektivität am NTS2 zu synthetisieren. Dies war möglich, indem das Tyrosin 11 in dem verkürzten Fragment NT(8-13) durch eine für diesen Zweck neu entwickelte D-Aminosäure mit Pyrazolopyridinylalanin-Struktur ersetzt wurde. Mit Hilfe derartiger Liganden hofft man, Krankheiten wie den neuropathischen Schmerz sicherer und wirksamer behandeln zu können. Weiterhin sehen wir das Potential, NTS2 tragende Tumore mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) im lebenden menschlichen Körper aufzuspüren. Für weiterführende Studien mit dem Ziel einer therapeutischen Nutzung wurde neben Arbeitsgruppen in Kanada und Südkorea auch eine verhaltenspharmakologisch arbeitende Gruppe in Texas auf unsere Arbeiten aufmerksam, mit der wir eine weitere Kooperation etablieren konnten.

In einem weiteren Projekt, in dem wir uns mit der Synthese von nicht peptidischen Neurotensin-Abkömmlinge beschäftigen, wurde ein neuartiger PET-Ligand dargestellt, der für die Diagnose von Neurotensin Rezeptor tragenden Tumoren herausragende Eigenschaften aufwies. Dieser Ligand fiel im Tiermodell durch eine sehr kurze Verweildauer in Organen wie Niere, Leber und Blut auf, während die Tumormarkierung sehr lange anhielt. Dies erachten wir als besonders günstig für die Vermeidung von irreversiblen Schäden in diesen Organen.

Abbildung: der visualisierte Rezeptor-Ligand-Komplex von NTS1 mit dem Neurotensin-Derivat NT(8-13)

Von Eva Marie Oberhauser

Im Rahmen meiner Doktorarbeit habe ich drei Projekte, alle in Kollaboration mit Arbeitskreisen in Frankfurt, Bonn und Marburg. Alle Projekte sind im Bereich photolabil geschützter RNA angesiedelt.

Projekt 1: Lichtinduzierte Faltung von Riboschaltern

Kollaboration mit AK Schwalbe, Uni Frankfurt

Riboschalter sind Strukturen in untranslatierten Regionen von mRNA, die je nach An- oder Abwesenheit eines Effektormoleküls Transkription oder Translation regulieren können. Bislang sind sie nur in Prokaryoten bekannt – mit einer einzigen Ausnahme des TPP (Thiaminpyrophosphat) – Riboschalters in Arabidopsis thaliana. Der jeweilige Schaltvorgang des Riboschalters resultiert aus dessen allosterischer Umfaltung, ausgelöst durch das Binden des Effektormoleküls.

Im Arbeitskreis Schwalbe an der Universität Frankfurt wurde in den letzten Jahren gezeigt, dass diese Faltungsprozesse auch mehr als nur zwei Zustände enthalten können. Zum Beispiel können die möglichen Faltungen beim sogenannten Adenin-bindenden Riboschalter aus Vibrio Vulnificus durchaus sehr komplex sein.

Um diese komplexen Faltungsvorgänge in ihrer Dynamik (auch und gerade in Abhängigkeit von äußeren Parametern) besser verstehen zu können, stellen wir Derivate der konformationell aktiven Abschschnitte der Riboschaltersequenzen her, die lichtaktivierbare Ribonukleoside enthalten. Diese können erst nach Aktivierung mit Licht mit ihrer komplementären Base paaren. Nur so können durch Variation der modifizierten Einheiten Nicht-Gleichgewichts-Zustände isoliert werden. Durch Licht als externem Triggersignal können dann die Relaxation des Nichtgleichgewichtszustand in das komplexe Gleichgewicht der vielfältigen Konformationszustände induziert werden. Die Methode, mit der diese Umfaltung im Arbeitskreis Schwalbe untersucht werden wird, ist die magnetische Kernresonanzspektroskopie (NMR).

Alle RNAs sind hergestellt, allerdings muss die zuletzt hergestellte RNA noch vermessen werden. Anschließend müssen alle Ergebnisse ausgewertet werden.

Unser Ziel in diesem Projekt ist ein verbessertes Verständnis für die (Thermo-)Dynamik der RNA- Faltung, um so z.B. verbesserte Riboschalter für das Feld der Synthetischen Biologie herzustellen.

Projekt 2: Photoschaltbares Intramer M69

Kollaboration mit AK Mayer, Bonn

M69 ist ein intrazellular wirksames RNA-Aptamer, ein so genanntes Intramer. Aptamere sind kleine einzelsträngige DNA- oder RNA-Oligonukleotide, die eine definierte dreidiemansionale Struktur haben. Sie binden Ihre Zielstruktur ähnlich wie Antikörper nach dem Schloss-Schlüssel-Prinzip und mit einer hohen Affinität und Selektivität. Cytohesin 1 spielt eine wichtige Rolle als Cofaktor bei Phosphorylieungsvorgängen von Transmembranproteinen. M69 bindet Cytohesin 1 an der Sec7-Domäne, diese Domäne ist für die Phosphorylierungsvorgänge essentiell. Durch die Bindung von M69 an Cytohesin 1 wird z.B. die T-Zelladhäsion an ICAM-1 unterdrückt [Mayer et al., PNAS (2001), 98, 4961-4965]. ICAM-1 ist ein Oberflächenprotein auf T- Zellen, welches mit LFA-1, ein weiteres Oberflächenprotein auf Antigenpräsentierenden Zellen, interagiert. Diese Wechselwirkung ist essentiell für die T-Zell-vermittelte Immunantwort bei uns Menschen.

Es ist erstrebenswert Aptamere mit Licht regulieren zu können, da auf diese Art (intrazelluläre) Prozesse mit einem „harmlosen“ externen Signal sehr präzise bei freier Wahl von Ort, Zeit und Dosis kontrolliert werden können. Die Arbeitsgruppen Heckel und Mayer haben bereits gezeigt, dass man einfache Aptamere durch Verwendung ähnlicher Nukleobasen-geschützter Bausteine wie in Projekt 1 mit Licht steuern kann. Dieses Konzept soll nun auf das sehr viel komplexere Intramer M69 ausgeweitet werden. Wiederum spielen hier die komplexen Faltungsmöglichkeiten von RNA die Hauptrolle. Erschwerend kommt ferner hinzu, dass dieses Intramer mit 94 Nukleotiden relativ lang ist, so dass die Synthese selbst noch eine weitere Herausforderung ist. Auf Grund von Erfahrungen im Arbeitskreis habe ich mich dazu entschieden die Sequenz in Volllänge her zu stellen und auf die Ligation zu verzichten.

Projekt 3: Lichtaktive siRNA und miRNA

siRNAs (small-interferring RNA) und miRNAs (micro-RNA) spielen eine zentrale Rolle bei der RNA-Interferenz (RNAi). Die RNAi ist ein Vorgang zur Genregulation auf translationeller Ebene in Eukaryonten. 2006 erhielten die amerikanischen Wissenschaftler Andreas Z. Fire und Craig C. Mello den Nobelpreis in Physiologie und Medizin für die Entdeckung der RNAi.

Beim Vorgang der RNAi lagern sich kleine nicht-codierende RNAs, wie siRNAs und miRNAs, an die mRNA (messenger-RNA) an, wodurch ein komplexer Vorgang, an dem viele verschiedene Enzyme beteiligt sind, in Gang gesetzt wird. Dadurch wird die mRNA entweder abgebaut oder stillgelegt, sodass sie nicht mehr abgelesen werden kann. Im Falle von siRNAs herrscht eine vollständige Komplementarität zwischen mRNA und siRNA, wohingegen miRNAs nicht vollständig komplementär zu ihrer Ziel-mRNA sind. Besonders wichtig für die Bindung von siRNA/miRNA an ihre Ziel-mRNA ist die sogenannte seed-Region, sie erstreckt sich über die Nukleotide 2-7 am 5‘-Ende.

In diesem Projekt geht es darum, durch gezieltes Einführen von lichtaktivierbaren Nukleobasen siRNAs und miRNAs lichtsensitiv zu machen. Durch das Einbringen von siRNAs/miRNAs die durch Licht aktiviert werden können, kann gezielt der Vorgang der RNAi ausgelöst werden.

Projekt 4: Lichtaktivierbares SAH/SAM

S – Adenosylhomocystein (SAH) bzw. S – Adenosylmethionin (SAM) sind wichtige Substanzen im Aminosäurestoffwechsel. SAM dient hierbei als Methyldonor wobei SAH Methylakzeptor ist. Die Bildung von SAM aus SAH erfolgt in den Zellen unteranderem unter ATP-Verbrauch.

SAH/SAM können aber auch als Liganden für Riboschalter fungieren. Hierbei gibt es drei Typen von Riboschaltern. Erstens die Riboschalter die nur SAM als Liganden erkennen, zweitens die, die nur SAH erkennen und drittens Mischtypen. Wie schon bei Projekt 1 aufgeführt sind Riboschalter bisher nur in Prokaryoten bekannt, dort üben sie je nach An- oder Abwesenheit des Effektormoleküls eine Hemmung bzw. Aktivierung der Transkription oder Translation aus.

In diesem Projekt geht es darum, in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis von Prof. Wöhnert in Frankfurt SAH/SAM-Riboschalter lichtabhängig im NMR zu untersuchen. Dazu wird der Ligand (SAH/SAM) an der Nukleobase photolabil geschützt. Aus Vorarbeiten der Gruppe ist bekannt, dass die Watson-Crick-Seite des Liganden essentiell für die Bindung an den Riboschalter ist. So lange diese Bindestelle nicht vorhanden ist, ist eine Bindung des Liganden an den Riboschalter nicht möglich, deshalb kann er sich nicht falten. Durch Bestrahlung mit Licht bei 365nm wird die Photoschutzgruppe entfernt und die Faltung kann im NMR zeitaufgelöst untersucht und verfolgt werden.

Mein Aufgabenbereich hierbei ist die Synthese des photolabil geschützten SAH/SAM.

Von PD Dr. med. Igor Tsaur
Klinik für Urologie und Kinderurologie
Goethe-Universität

Berichterstattung der Vorarbeiten im Jahr 2014

Lösliche Proteine, die eine signifikante Rolle für die Tumorgenese oder – dissemination verschiedener Neoplasien spielen und somit eventuell als molekulare Biomarker fungieren könnten, wurden auf ihr diagnostisches Potential beim Prostatakarzinom (PCa) mittels Proteome ProfilerTM Antibody Array in Serumproben von 20 PCa Patienten und 10 Kontrollen überprüft. Es wurden Kandidatenmoleküle mit der größten Expressionsdifferenz zwischen den Tumor- und Kontrollpatienten identifiziert und einer weiteren, exakten Analyse mittels des ELISA-Testverfahrens unterzogen

Insgesamt bei 172 PCa und 20 gesunden Kontrollpatienten wurden ELISA-Messungen bzgl des Proteingehalts von E-Selectin, sE-Cadherin, TIMP1, MMP2, MMP9, Galectin und Clusterin durchgeführt. Derzeit werden die Expressionsprofile der einzelnen Kandidatenproteine im Hinblick auf die klinisch-pathologischen Parameter der Patienten ausgewertet (u.a. Expressionsunterschied bei Tumorpatienten versus gesunden Probanden, Korrelation mit dem präoperativen PSA-Wert, T-Stadium, N-Status des Lymphknotenbefalls, Grading und Gleason Score der Prostatastanzbiopsie und Prostataresektats, R-Status und Status der Perineuralscheideninvasion (Pn1) des endgültigen Präparats der radikalen Prostatektomie).

Desweiteren wurde als Vorbereitung für die Fortsetzung des Projekts die Funktionalität des Kandidatenmoleküls Chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2) in vitro analysiert. CCL2 wurde zuvor als bei PCa Patienten hochreguliertes Molekül identifiziert (1). Wir konnten anhand biologischer Modellsysteme demonstrieren, dass CCL2 die Adhäsion von PCa-Zellen stimuliert und Veränderungen spezifischer Adhäsionsrezeptoren vom Integrintyp an der Zelloberfläche induziert. Die Veränderungen korrelierten mit dem aggressiven Adhäsionsverhalten der Tumorzellen. Eine Blockade der Integrine könnte somit therapeutisches Potential für das fortgeschrittene und metastasierte Prostatakarzinom beinhalten. Diese Studie wurde kürzlich publiziert (2) und die Dr. Illing Stiftung als Sponsor aufgeführt.

Referenzliste

1. Tsaur I, Makarevic J, Oppermann E, Waaga-Gasser A-M, Gasser M, Borgmann H,
   Huesch T, Gust K, Reiter M, Schilling D, Bartsch G, Haferkamp A, Blaheta R (2014) CCL2 chemokine as a potential biomarker for prostate cancer: a pilot study. Cancer Res Treat in press.
2. Tsaur I, Rutz J, Makarević J, Juengel E, Gust KM, Borgmann H, Schilling D, Nelson K, Haferkamp A, Bartsch G, Blaheta RA. CCL2 promotes integrin-mediated adhesion of prostate cancer cells in vitro. World J Urol Sep 2. 2014 [Epub ahead of print].

Neurotensin Rezeptorliganden als potentielle Analgetika, Tumortherapeutika oder Antipsychotika

Das Neuropeptid Neurotensin wird als Ausgangspunkt für die Behandlung der Schizophrenie, von starken Schmerzen, aber auch von Tumoren angesehen. Diese möglichen therapeutischen Wirkungen werden vor allem über die beiden molekularen Zielstrukturen Neurotensin Rezeptor 1 und 2 (NTS1 und NTS2) des menschlichen Körpers vermittelt. In den laufenden, von der Dr. Illing Stiftung geförderten Projekten gelang es unserer Forschergruppe, abbauverzögerte Neurotensin-Abkömmlinge darzustellen, die hauptsächlich den für die Schmerzverarbeitung verantwortlichen Neurotensin-Rezeptor NTS2 adressieren. Weiterführende Studien mit dem Ziel einer therapeutischen Nutzung werden zur Zeit durchgeführt. Zusammen mit unseren Kooperationspartnern in Kanada konnten wir erste Erfolg versprechende Ergebnisse erzielen. Darüber hinaus konnten wir eine weitere Kooperation mit Schmerzforschern aus Südkorea etablieren.

Abbildung: der visualisierte Rezeptor-Ligand-Komplex von NTS1 mit dem Neurotensin-Derivat NT(8-13)

In einem weiteren Projekt, das sich ebenfalls die Synthese abbauverzögerter Neurotensin-Abkömmlinge zunutze macht, wurden Verbindungen dargestellt, die möglicherweise die Therapie von Neurotensin Rezeptor 1 tragenden Tumoren erlaubt. Dies gelang durch Einführung von chemischen Hilfsgruppen, die den beta-Strahler 177Lutetium tragen. Bei der Untersuchung dieser Substanzen im Tiermodell, die in der Arbeitsgruppe von Prof. Olaf Prante durchgeführt wurden, zeigte sich eine gut erkennbare Wachstumsverzögerung eines ins Versuchstier implantierten Tumors. Weiterhin gelang es uns, Diagnostika zu synthetisieren, die eine Visualisierung von Neurotensin Rezeptor 2 tragenden Tumoren erlauben.

Januar 2014, Jahresbericht 2013

Beginn: 17. Oktober 2011
Thema: Modulation von Aptameraktivität mit Licht
Im Rahmen meiner Doktorarbeit habe ich drei Projekte, alle in Kollaboration mit Arbeitskreisen in Frankfurt, Bonn und Marburg. Alle Projekte sind im Bereich photolabil geschützter RNA angesiedelt.

Projekt 1: Lichtinduzierte Faltung von Riboschaltern
Kollaboration mit AK Schwalbe, Uni Frankfurt
Faltung des Riboschalters

Im Arbeitskreis Schwalbe an der Universität Frankfurt wurde in den letzten Jahren gezeigt, dass diese Faltungsprozesse auch mehr als nur zwei Zustände enthalten können. Zum Beispiel können die möglichen Faltungen beim sogenannten Adenin-bindenden Riboschalter aus Vibrio Vulnificus durchaus sehr komplex sein.
Um diese komplexen Faltungsvorgänge in ihrer Dynamik (auch und gerade in Abhängigkeit von äußeren Parametern) besser verstehen zu können, stellen wir Derivate der konformationell aktiven Abschschnitte der Riboschaltersequenzen her, die lichtaktivierbare Ribonukleoside enthalten. Diese können erst nach Aktivierung mit Licht mit ihrer komplementären Base paaren. Nur so können durch Variation der modifizierten Einheiten Nicht-Gleichgewichts-Zustände isoliert werden. Durch Licht als externem Triggersignal können dann die Relaxation des Nichtgleichgewichtszustand in das komplexe Gleichgewicht der vielfältigen Konformationszustände induziert werden. Die Methode, mit der diese Umfaltung im Arbeitskreis Schwalbe untersucht werden wird, ist die magnetische Kernresonanzspektroskopie (NMR).
Wie im Vorjahr berichtet, konnte ich im ersten Jahr meiner Doktorarbeit eine entsprechende lichtaktivierbare RNA in den für NMR-Untersuchungen benötigten relativ hohen Mengen hergestellt, gereinigt und charakterisiert werden. Im vergangen Jahr konnte auch die zweite RNA hergestellt, gereinigt, charakterisiert und vermessen werden. Allerdings haben neuere Untersuchungen gezeigt, dass erstere Sequenz an einer ungünstigen Stelle destabilisert wurde, weshalb wir nun eine andere RNA-Base gegen eine lichtaktivierbare RNA-Base austauschen werden.
Unser Ziel in diesem Projekt ist ein verbessertes Verständnis für die (Thermo-)Dynamik der RNA- Faltung, um so z.B. verbesserte Riboschalter für das Feld der Synthetischen Biologie herzustellen.

Projekt 2: Photoschaltbares Intramer M69
Kollaboration mit AK Mayer, Bonn
M69 ist ein intrazellular wirksames RNA-Aptamer, ein so genanntes Intramer. Aptamere sind kleine einzelsträngige DNA- oder RNA-Oligonukleotide, die eine definierte dreidiemansionale Struktur haben. Sie binden Ihre Zielstruktur ähnlich wie Antikörper nach dem Schloss-Schlüssel-Prinzip und mit einer hohen Affinität und Selektivität. Cytohesin 1 spielt eine wichtige Rolle als Cofaktor bei Phosphorylieungsvorgängen von Transmembranproteinen. M69 bindet Cytohesin 1 an der Sec7-Domäne, diese Domäne ist für die Phosphorylierungsvorgänge essentiell. Durch die Bindung von M69 an Cytohesin 1 wird z.B. die T-Zelladhäsion an ICAM-1 unterdrückt [Mayer et al., PNAS (2001), 98, 4961-4965]. ICAM-1 ist ein Oberflächenprotein auf T- Zellen, welches mit LFA-1, ein weiteres Oberflächenprotein auf Antigenpräsentierenden Zellen, interagiert. Diese Wechselwirkung ist essentiell für die T-Zell-vermittelte Immunantwort bei uns Menschen.
Es ist erstrebenswert Aptamere mit Licht regulieren zu können, da auf diese Art (intrazelluläre) Prozesse mit einem „harmlosen“ externen Signal sehr präzise bei freier Wahl von Ort, Zeit und Dosis kontrolliert werden können. Die Arbeitsgruppen Heckel und Mayer haben bereits gezeigt, dass man einfache Aptamere durch Verwendung ähnlicher Nukleobasen-geschützter Bausteine wie in Projekt 1 mit Licht steuern kann. Dieses Konzept soll nun auf das sehr viel komplexere Intramer M69 ausgeweitet werden. Wiederum spielen hier die komplexen Faltungsmöglichkeiten von RNA die Hauptrolle. Erschwerend kommt ferner hinzu, dass dieses Intramer mit 94 Nukleotiden relativ lang ist, so dass die Synthese selbst noch eine weitere Herausforderung ist. Eine Möglichkeit ist die Herstellung von zwei kürzeren Fragmenten und deren anschließende Ligation. Allerdings ist die Ligation von RNA deutlich weniger einfach als die von DNA.

Zu meinen Aufgaben in diesem Projekt gehören die Synthese der photolabil geschützten Sequenzen und die anschließende Ligation mit den unmodifizierten Sequenzen.

Projekt 3: Lichtaktive siRNA und miRNA
siRNAs (small-interferring RNA) und miRNAs (micro-RNA) spielen eine zentrale Rolle bei der RNA-Interferenz (RNAi). Die RNAi ist ein Vorgang zur Genregulation auf translationeller Ebene in Eukaryonten. 2006 erhielten die amerikanischen Wissenschaftler Andreas Z. Fire und Craig C. Mello den Nobelpreis in Physiologie und Medizin für die Entdeckung der RNAi.
Beim Vorgang der RNAi lagern sich kleine nicht-codierende RNAs, wie siRNAs und miRNAs, an die mRNA (messenger-RNA) an, wodurch ein komplexer Vorgang, an dem viele verschiedene Enzyme beteiligt sind, in Gang gesetzt wird. Dadurch wird die mRNA entweder abgebaut oder stillgelegt, sodass sie nicht mehr abgelesen werden kann. Im Falle von siRNAs herrscht eine vollständige Komplementarität zwischen mRNA und siRNA, wohingegen miRNAs nicht vollständig komplementär zu ihrer Ziel-mRNA sind. Besonders wichtig für die Bindung von siRNA/miRNA an ihre Ziel-mRNA ist die sogenannte seed-Region, sie erstreckt sich über die Nukleotide 2-7 am 5‘-Ende.
In diesem Projekt geht es darum, durch gezieltes Einführen von lichtaktivierbaren Nukleobasen siRNAs und miRNAs lichtsensitiv zu machen. Durch das Einbringen von siRNAs/miRNAs die durch Licht aktiviert werden können, kann gezielt der Vorgang der RNAi ausgelöst werden.

Kurzbeschreibung des Projektes

Trypanosomen-spezifisches RNA-Molekül

Generelles Ziel der durch die Dr. Illing-Stiftung geförderten Projekte ist die Suche nach neuen Reagenzien zur Diagnostik und Therapie von Infektionskrankheiten und hier speziell von Parasiteninfektionen. Im Zentrum der Untersuchungen steht der Blutparasit Trypanosoma brucei, der Auslöser der Schlafkrankheit beim Menschen bzw. der Nagana-Seuche bei Rindern. Gegen keine der Krankheiten gibt es eine Vakzinierung oder wirksame Chemotherapie. Die Parasiten entziehen sich der Immunantwort durch die fortlaufende Veränderung ihrer Zelloberfläche. Wie wir in den vergangenen Jahre zeigen konnten, lässt sich die Oberflächenvariation dadurch umgehen, indem unveränderliche Teilbereiche der Parasitenoberfläche von hochaffin-bindenden Nukleinsäuren, sogenannten Aptameren, belegt werden. Aptamere lassen sich chemisch synthetisieren und durch Derivatisierung zu neuen therapeutisch und diagnostisch wirksamen Verbindungen umwandeln.

Weitere Informationen
www.bio.tu-darmstadt.de/forschen/forschen_1/ag_goringer/index.de.jsp