Thema: Modulation von Aptameraktivität mit Licht / Bericht 2014

Von Eva Marie Oberhauser

Im Rahmen meiner Doktorarbeit habe ich drei Projekte, alle in Kollaboration mit Arbeitskreisen in Frankfurt, Bonn und Marburg. Alle Projekte sind im Bereich photolabil geschützter RNA angesiedelt.

Projekt 1: Lichtinduzierte Faltung von Riboschaltern

Kollaboration mit AK Schwalbe, Uni Frankfurt

Faltung des Riboschalters

Riboschalter sind Strukturen in untranslatierten Regionen von mRNA, die je nach An- oder Abwesenheit eines Effektormoleküls Transkription oder Translation regulieren können. Bislang sind sie nur in Prokaryoten bekannt – mit einer einzigen Ausnahme des TPP (Thiaminpyrophosphat) – Riboschalters in Arabidopsis thaliana. Der jeweilige Schaltvorgang des Riboschalters resultiert aus dessen allosterischer Umfaltung, ausgelöst durch das Binden des Effektormoleküls.

Im Arbeitskreis Schwalbe an der Universität Frankfurt wurde in den letzten Jahren gezeigt, dass diese Faltungsprozesse auch mehr als nur zwei Zustände enthalten können. Zum Beispiel können die möglichen Faltungen beim sogenannten Adenin-bindenden Riboschalter aus Vibrio Vulnificus durchaus sehr komplex sein.

Um diese komplexen Faltungsvorgänge in ihrer Dynamik (auch und gerade in Abhängigkeit von äußeren Parametern) besser verstehen zu können, stellen wir Derivate der konformationell aktiven Abschschnitte der Riboschaltersequenzen her, die lichtaktivierbare Ribonukleoside enthalten. Diese können erst nach Aktivierung mit Licht mit ihrer komplementären Base paaren. Nur so können durch Variation der modifizierten Einheiten Nicht-Gleichgewichts-Zustände isoliert werden. Durch Licht als externem Triggersignal können dann die Relaxation des Nichtgleichgewichtszustand in das komplexe Gleichgewicht der vielfältigen Konformationszustände induziert werden. Die Methode, mit der diese Umfaltung im Arbeitskreis Schwalbe untersucht werden wird, ist die magnetische Kernresonanzspektroskopie (NMR).

Alle RNAs sind hergestellt, allerdings muss die zuletzt hergestellte RNA noch vermessen werden. Anschließend müssen alle Ergebnisse ausgewertet werden.

Unser Ziel in diesem Projekt ist ein verbessertes Verständnis für die (Thermo-)Dynamik der RNA- Faltung, um so z.B. verbesserte Riboschalter für das Feld der Synthetischen Biologie herzustellen.

 

Projekt 2: Photoschaltbares Intramer M69

Kollaboration mit AK Mayer, Bonn

M69 ist ein intrazellular wirksames RNA-Aptamer, ein so genanntes Intramer. Aptamere sind kleine einzelsträngige DNA- oder RNA-Oligonukleotide, die eine definierte dreidiemansionale Struktur haben. Sie binden Ihre Zielstruktur ähnlich wie Antikörper nach dem Schloss-Schlüssel-Prinzip und mit einer hohen Affinität und Selektivität. Cytohesin 1 spielt eine wichtige Rolle als Cofaktor bei Phosphorylieungsvorgängen von Transmembranproteinen. M69 bindet Cytohesin 1 an der Sec7-Domäne, diese Domäne ist für die Phosphorylierungsvorgänge essentiell. Durch die Bindung von M69 an Cytohesin 1 wird z.B. die T-Zelladhäsion an ICAM-1 unterdrückt [Mayer et al., PNAS (2001), 98, 4961-4965]. ICAM-1 ist ein Oberflächenprotein auf T- Zellen, welches mit LFA-1, ein weiteres Oberflächenprotein auf Antigenpräsentierenden Zellen, interagiert. Diese Wechselwirkung ist essentiell für die T-Zell-vermittelte Immunantwort bei uns Menschen.

Es ist erstrebenswert Aptamere mit Licht regulieren zu können, da auf diese Art (intrazelluläre) Prozesse mit einem „harmlosen“ externen Signal sehr präzise bei freier Wahl von Ort, Zeit und Dosis kontrolliert werden können. Die Arbeitsgruppen Heckel und Mayer haben bereits gezeigt, dass man einfache Aptamere durch Verwendung ähnlicher Nukleobasen-geschützter Bausteine wie in Projekt 1 mit Licht steuern kann. Dieses Konzept soll nun auf das sehr viel komplexere Intramer M69 ausgeweitet werden. Wiederum spielen hier die komplexen Faltungsmöglichkeiten von RNA die Hauptrolle. Erschwerend kommt ferner hinzu, dass dieses Intramer mit 94 Nukleotiden relativ lang ist, so dass die Synthese selbst noch eine weitere Herausforderung ist. Auf Grund von Erfahrungen im Arbeitskreis habe ich mich dazu entschieden die Sequenz in Volllänge her zu stellen und auf die Ligation zu verzichten.

 

Projekt 3: Lichtaktive siRNA und miRNA

siRNAs (small-interferring RNA) und miRNAs (micro-RNA) spielen eine zentrale Rolle bei der RNA-Interferenz (RNAi). Die RNAi ist ein Vorgang zur Genregulation auf translationeller Ebene in Eukaryonten. 2006 erhielten die amerikanischen Wissenschaftler Andreas Z. Fire und Craig C. Mello den Nobelpreis in Physiologie und Medizin für die Entdeckung der RNAi.

Beim Vorgang der RNAi lagern sich kleine nicht-codierende RNAs, wie siRNAs und miRNAs, an die mRNA (messenger-RNA) an, wodurch ein komplexer Vorgang, an dem viele verschiedene Enzyme beteiligt sind, in Gang gesetzt wird. Dadurch wird die mRNA entweder abgebaut oder stillgelegt, sodass sie nicht mehr abgelesen werden kann. Im Falle von siRNAs herrscht eine vollständige Komplementarität zwischen mRNA und siRNA, wohingegen miRNAs nicht vollständig komplementär zu ihrer Ziel-mRNA sind. Besonders wichtig für die Bindung von siRNA/miRNA an ihre Ziel-mRNA ist die sogenannte seed-Region, sie erstreckt sich über die Nukleotide 2-7 am 5‘-Ende.

In diesem Projekt geht es darum, durch gezieltes Einführen von lichtaktivierbaren Nukleobasen siRNAs und miRNAs lichtsensitiv zu machen. Durch das Einbringen von siRNAs/miRNAs die durch Licht aktiviert werden können, kann gezielt der Vorgang der RNAi ausgelöst werden.

 

Projekt 4: Lichtaktivierbares SAH/SAM

S – Adenosylhomocystein (SAH) bzw. S – Adenosylmethionin (SAM) sind wichtige Substanzen im Aminosäurestoffwechsel. SAM dient hierbei als Methyldonor wobei SAH Methylakzeptor ist. Die Bildung von SAM aus SAH erfolgt in den Zellen unteranderem unter ATP-Verbrauch.

SAH/SAM können aber auch als Liganden für Riboschalter fungieren. Hierbei gibt es drei Typen von Riboschaltern. Erstens die Riboschalter die nur SAM als Liganden erkennen, zweitens die, die nur SAH erkennen und drittens Mischtypen. Wie schon bei Projekt 1 aufgeführt sind Riboschalter bisher nur in Prokaryoten bekannt, dort üben sie je nach An- oder Abwesenheit des Effektormoleküls eine Hemmung bzw. Aktivierung der Transkription oder Translation aus.

In diesem Projekt geht es darum, in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis von Prof. Wöhnert in Frankfurt SAH/SAM-Riboschalter lichtabhängig im NMR zu untersuchen. Dazu wird der Ligand (SAH/SAM) an der Nukleobase photolabil geschützt. Aus Vorarbeiten der Gruppe ist bekannt, dass die Watson-Crick-Seite des Liganden essentiell für die Bindung an den Riboschalter ist. So lange diese Bindestelle nicht vorhanden ist, ist eine Bindung des Liganden an den Riboschalter nicht möglich, deshalb kann er sich nicht falten. Durch Bestrahlung mit Licht bei 365nm wird die Photoschutzgruppe entfernt und die Faltung kann im NMR zeitaufgelöst untersucht und verfolgt werden.

Mein Aufgabenbereich hierbei ist die Synthese des photolabil geschützten SAH/SAM.

Die Kommentarfunktion ist geschlossen.